伯豪生物助力 《Cancer Letters》發現治療ICC新靶標

肝內膽管癌（ICC）是引起原發性肝癌的重要原因之一。由于化療的無效性和術后生存率的低比例，尋找治療ICC的有效靶點一直是科學家關注的重點。來自浙江大學醫學部的研究人員通過臨床樣本，細胞系功能實驗的研究，發現PDZ binding motif（TAZ）的異常表達與病人生存率相關，且通過調控p53/CYP24A1 pathway 影響細胞凋亡和對Vitamin D3 的敏感性。該研究的發現為治療ICC提供了一個新的治療靶標。

1. TAZ在病人中的表達模式特征
TAZ被發現是Hippo-related pathways的核效應靶點而調控器官大小，腫瘤干細胞性能和腫瘤發現。但是，TAZ是否與ICC有關聯，目前還沒有相關研究。研究人員首先在41對ICC病人組織樣本進行了免疫組化實驗，發現tumor grade和tumor stage與TAZ表達呈正相關。

對12對ICC樣本進行RT-PCR驗證發現，TAZ mRNA的表達在腫瘤組織中明顯高于癌旁組織。對41個病人術后生存率分析顯示，高表達TAZ組伴隨著低生存率，而低表達組的相對生存率明顯高。因此，TAZ的表達與ICC有著密切的關聯。

2. 敲降TAZ細胞系表型分析
為探究TAZ表達與ICC發生的關系，研究人員首先在ICC細胞系中分析了蛋白表達，發現在CCLP-1和RBE中顯著高于TFK-1和HCCC-9810細胞。因此，在CCLP-1和RBE中進行了TAZ的敲降。結果顯示，敲降TAZ后細胞活性被顯著抑制。

流式細胞分析表明，敲降TAZ后，細胞凋亡增強，G1 phase阻滯增加。Western blot檢測限制，Bak, Bad, Bax, caspase 3的表達顯著上調，CDK2，CDK4，cyclin D1表達下調，因此，TAZ的敲降影響了細胞的增殖，凋亡和細胞周期過程。

3. TAZ調控下游基因篩選
那么，TAZ是調控了下游哪些基因的表達而影響細胞的上述生物學功能呢？通過全基因組表達譜芯片（該研究中Affymetrix Human U133 plus2.0 array芯片服務由上海伯豪生物技術有限公司提供），研究人員發現CYP24A1的mRNA表達在TAZ敲降后顯著下調。RT-PCR和western bolt實驗，進一步驗證CYP24A1在敲降后顯著下調。CYP24A1在ICC腫瘤組織中的表達與TAZ正相關。因此，CYP24A1是潛在的TAZ作用下游靶基因。

4. TAZ影響ICC細胞對vitamin D的敏感性
通過對ICC細胞處理vitamin D，研究人員發現細胞活性受到抑制。而在TAZ敲降后，ICC的敏感性增加。當在細胞中處理si-TAZ時，同時處理vitamin D，發現兩則是一種協同增強作用。因此，TAZ的降低增強了ICC細胞對vitamin D的敏感性。

5. TAZ調控網絡分析
那么，TAZ是怎么樣調控CYP24A1和VDR（vitamin D receptor）呢？結果顯示，敲降TAZ降低了VDR的表達，升高了p53, p27, p21的表達。vitamin D可以有效下調VDR，CYP24A1，TAZ的表達，上調p53的表達。當以si-TAZ, vitamin D3, si-TAZ+ vitamin D3處理細胞時，在組合組中，p53和p21顯著增加，VDR和CYP24A1顯著降低。exnograft實驗來源腫瘤的免疫組化檢測也表明p21, p27, p53, Bak, Bax表達增加，而CYP24A1, VDR, Bcl-2, CDK2 , Ki-67表達降低。此外，通過構建si-CYP24A1，發現TAZ表達降低，VDR不變。當增加Nutlin3a（MDM2拮抗劑）量，p53表達逐步上調，TAZ和CYP24A1表達逐步下調。當將p53進行siRNA設計時，CYP24A1表達上升。因此，在ICC中，可能是由于TAZ通過抑制p53的表達，影響了對于Vitamin D3的敏感性，抑制了細胞凋亡和細胞周期。

本研究通過對臨床樣本分析，發現TAZ的表達與病人生存期，腫瘤分期顯著相關。利用敲降細胞系，發現TAZ通過影響p53/CYP24A1 pathway ,影響了細胞的凋亡，細胞周期和對vitamin D的敏感性。該研究在ICC中發現了一個潛在的治療靶點，為治療ICC提供了新的思路。

原文出處：Xiao H, Tong R, Yang B, Lv Z, Du C, Peng C, Ding C, Cheng S, Zhou L, Xie H, Wu J, Zheng S. TAZ regulates cell proliferation and sensitivity to vitamin D3 in intrahepatic cholangiocarcinoma. Cancer Lett.2016.